PCR操作時應(yīng)注意的事項

PCR檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導(dǎo)致各種問題，因此，進(jìn)行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。關(guān)鍵詞：PCR操作
PCR檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導(dǎo)致各種問題，因此，進(jìn)行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
（1）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
① 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；
② PCR擴增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴增；
③ 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
（2）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
① PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；
② 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制；
③ 引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標(biāo)明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。
(3) 實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
① 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；
② 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
③ 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
④ 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；
⑤ 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；
⑥ 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；
⑦ 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；
⑧ 重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。