一、基本概念和術語
1．色譜圖和峰參數(shù)
?色譜圖(chromatogram)——樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elution profile)。
?基線(base line)——經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
?噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
?漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。
?色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時響應的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少見。
?拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)?！吨袊幍洹芬?guī)定T應為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。
?峰底——基線上峰的起點至終點的距離。
?峰高(peak height，h)——峰的最高點至峰底的距離。
?峰寬(peak width，W)——峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ
?半峰寬(peak width at half-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ
?標準偏差(standard deviation，σ)——正態(tài)分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
?峰面積(peak area，A)——峰與峰底所包圍的面積。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 Wh/2 h
2．定性參數(shù)（保留值）
?死時間(dead time，t0)——不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
?死體積(dead volume，V0)——由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
?保留時間(retention time，tR)——從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。
?保留體積(retention volume，VR)——從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR
?調(diào)整保留時間(adjusted retention time，t'R)——扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced retention time)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0
?調(diào)整保留體積(adjusted retention volume，V'R)——扣除死體積后的保留體積。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R
3．柱效參數(shù)
?理論塔板數(shù)(theoretical plate number，N)——用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，N可近似表示為：
N＝()2＝16()2＝5.54()2
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調(diào)整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。
?理論塔板高度(theoretical plate height，H)——每單位柱長的方差。H＝。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算：H＝，H有效＝。
4．相平衡參數(shù)
?分配系數(shù)(distribution coefficient，K)——在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K＝。
分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質(zhì)有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)?。ɑ蚍Q交換系數(shù)），凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很?。r，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
?容量因子(capacity factor，k)——化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。k＝。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。
分配系數(shù)、容量因子與保留時間之間有如下關系：k＝＝＝K＝，t'R＝k t0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t'R）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t'R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數(shù)的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質(zhì)及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質(zhì)及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于t'R、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數(shù)應用更廣泛。
?選擇性因子(selectivity factor，α)——相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α＝＝ （設k2＞k1）。因k＝t'R/t0，則α＝，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。
5．分離參數(shù)
?分離度(resolution，R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R＝。當W1＝W2時，R＝。當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離，裸露峰面積為95.4%，內(nèi)側(cè)峰基重疊約2%。R＝1.5時，稱為6σ分離，裸露峰面積為99.7%。R≥1.5稱為完全分離?！吨袊幍洹芬?guī)定R應大于1.5。
?基本分離方程——分離度與三個色譜基本參數(shù)有如下關系：
R＝××
其中稱為柱效項，為柱選擇性項，為柱容量項。柱效項與色譜過程動力學特性有關，后兩項與色譜過程熱力學因素有關。
從基本分離方程可看出，提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a. 改變流動相的組成及pH值；b. 改變柱溫；c. 改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。k2趨于0時，R也趨于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否則不但分離時間延長，而且峰形變寬，會影響分離度和檢測靈敏度。一般k2在1~10范圍內(nèi)，最好為2~5，窄徑柱可更小些。
二、塔板理論
1．塔板理論的基本假設
塔板理論是Martin和Synger首先提出的色譜熱力學平衡理論。它把色譜柱看作分餾塔，把組分在色譜柱內(nèi)的分離過程看成在分餾塔中的分餾過程，即組分在塔板間隔內(nèi)的分配平衡過程。塔板理論的基本假設為：
1） 色譜柱內(nèi)存在許多塔板，組分在塔板間隔（即塔板高度）內(nèi)完全服從分配定律，并很快達到分配平衡。
2） 樣品加在第0號塔板上，樣品沿色譜柱軸方向的擴散可以忽略。
3） 流動相在色譜柱內(nèi)間歇式流動，每次進入一個塔板體積。
4） 在所有塔板上分配系數(shù)相等，與組分的量無關。
雖然以上假設與實際色譜過程不符，如色譜過程是一個動態(tài)過程，很難達到分配平衡；組分沿色譜柱軸方向的擴散是不可避免的。但是塔板理論導出了色譜流出曲線方程，成功地解釋了流出曲線的形狀、濃度極大點的位置，能夠評價色譜柱柱效。
2．色譜流出曲線方程及定量參數(shù)（峰高h和峰面積A）
根據(jù)塔板理論，流出曲線可用下述正態(tài)分布方程來描述：
C＝e 或 C＝e
由色譜流出曲線方程可知：當t＝tR時，濃度C有極大值，Cmax＝。Cmax就是色譜峰的峰高。因此上式說明：①當實驗條件一定時（即σ一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②當進樣量一定時，σ越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的靈敏度。
由流出曲線方程對V(0~∞) 求積分，即得出色譜峰面積A＝×σ×Cmax＝C0?？梢夾相當于組分進樣量C0，因此是常用的定量參數(shù)。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此為正常峰的峰面積計算公式。
三、速率理論（又稱隨機模型理論）
1．液相色譜速率方程
1956年荷蘭學者Van Deemter等人吸收了塔板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學因素結合起來，提出了色譜過程的動力學理論——速率理論。它把色譜過程看作一個動態(tài)非平衡過程，研究過程中的動力學因素對峰展寬（即柱效）的影響。
后來Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H＝A＋B/u＋Cu，后稱氣相色譜速率方程）的基礎上，根據(jù)液體與氣體的性質(zhì)差異，提出了液相色譜速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp＋＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2p＋\s\up 5(2f
2．影響柱效的因素
1）渦流擴散（eddy diffusion）。由于色譜柱內(nèi)填充劑的幾何結構不同，分子在色譜柱中的流速不同而引起的峰展寬。渦流擴散項A＝2λdp，dp為填料直徑，λ為填充不規(guī)則因子，填充越不均勻λ越大。HPLC常用填料粒度一般為3~10μm，最好3~5μm，粒度分布RSD≤5%。但粒度太小難于填充均勻（λ大），且會使柱壓過高。大而均勻（球形或近球形）的顆粒容易填充規(guī)則均勻，λ越小?？偟恼f來，應采用細而均勻的載體，這樣有助于提高柱效。毛細管無填料，A＝0。
2）分子擴散（molecular diffusion）。又稱縱向擴散。由于進樣后溶質(zhì)分子在柱內(nèi)存在濃度梯度，導致軸向擴散而引起的峰展寬。分子擴散項B/u＝2γDm/u。u為流動相線速度，分子在柱內(nèi)的滯留時間越長（u小），展寬越嚴重。在低流速時，它對峰形的影響較大。Dm為分子在流動相中的擴散系數(shù)，由于液相的Dm很小，通常僅為氣相的10-4~10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的話，這一項可以忽略不計。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴散，而引入的柱參數(shù)，用以對Dm進行校正。γ一般在0.6~0.7左右，毛細管柱的γ＝1。
3）傳質(zhì)阻抗（mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜態(tài)流動相和固定相中的傳質(zhì)過程而導致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動相和固定相中的擴散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質(zhì)速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項Cu又分為三項。
①流動相傳質(zhì)阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm為常數(shù)。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致?？拷畛漕w粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達到分配平衡就隨流動相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。
②靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗Hsm＝Csmd2pu/Dm，Csm為常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。Hsm對峰展寬的影響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進固定相結構，減小靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關鍵。
Hm和Hsm都與固定相的粒徑平方d2p 成正比，與擴散系數(shù)Dm成反比。因此應采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大Dm，但用有機溶劑作流動相時，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。
③固定相傳質(zhì)阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色譜），Cs為常數(shù)，df為固定液的液膜厚度，Ds為分子在固定液中的擴散系數(shù)。在分配色譜中Hs與df的平方成正比，在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略。
從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導致嚴重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當?shù)牧魉?。以H對u作圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時，H最小。一般在液相色譜中，uopt很?。ù蠹s0.03~0.1mm/s），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。
3．柱外效應
速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即：
σ2＝σ2柱內(nèi)＋σ2柱外＋σ2其它
柱外效應主要由低劣的進樣技術、從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，如使用“零死體積接頭”連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應盡可能小。研究表明柱外死體積之和應＜VR/。其次，希望將樣品直接進在柱頭的中心部位，但是由于進樣閥與柱間有接頭，柱外效應總是存在的。此外，要求進樣體積≤VR/2。
柱外效應的直觀標志是容量因子k小的組分（如k＜2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯；k大的組分影響不顯著。由于HPLC的特殊條件，當柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小時，柱外效應越顯得突出。而在經(jīng)典LC中則影響相對較小。