HPLC分析樣品原則：

是否為高分子化合物、粘度大、具有生物活性的生物分子、有些或全部的樣品成分是否可電離(根據(jù)這樣條件可選擇色譜柱、流動相、柱溫、流速、離子對試劑、是否需要預(yù)處理等等)...... 　　具體分析：首先應(yīng)了解樣品的溶解性質(zhì)，判斷樣品分子量的大小以及可能存在的分子結(jié)構(gòu)及分析特性，最后再選擇HPLC的分離模式，以完成對樣品的分析?！　悠返娜芙舛?，由樣品在有機(jī)溶劑中溶解度的大小，初步判斷樣品是非極性化合物還是極性化合物，若樣品溶于非極性溶劑，表明樣品為非極性化合物，通?？梢赃x吸附色譜法或正相分配色譜法、正相健合色譜法進(jìn)行分析?？鄻悠啡苡跇O性溶劑或相混溶的極性溶劑，表明樣品為極性化合物，通常選用反相分配色譜法或更為廣泛應(yīng)用的反相鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若樣品溶于水相，可首先檢查水溶液的pH值，若呈中性為非離子型組分，?？捎梅聪?或正相)鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若pH 呈弱酸性，可采用抑制樣品電離的方法，在流動相中加入硫酸、磷酸調(diào)節(jié)pH=2～3，再用反相鍵合相色譜法進(jìn)行分析。若pH呈弱堿性，則可向流動相中加入陽離子型反離子，再用離子對色譜法進(jìn)行分析。若pH呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性，則可用離子色譜法進(jìn)行分析。由于除去固定相中的離子對試劑較慢，當(dāng)改變流動相時，有時需要長時間的平衡;再由于離子對試劑純度問題，使離子對中的基線波動問題和干擾問題現(xiàn)象比較常見?！　?yōu)化條件在于最終色譜圖中能產(chǎn)生出最嗌分開的譜峰。了解化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，知道是否存在酸或堿，當(dāng)流動相的pH值=混合物的平均pKa值或接近時,可能會使分離較好。先優(yōu)化K;隨著容量因子的增加，譜峰會展寬，峰形變矮。(當(dāng)所有譜峰符合1<20的范圍時，其流動相已接近最佳了;再Α(≥1.05);最后優(yōu)化N，不同微粒的柱子均有一個最佳流速，流速再高會降低N值;如果降低流速，則會增加工作時間，但分離度會更好。當(dāng)流動相粘度增加時，N值也將降低;因此盡可能使用低粘度的溶劑。用最小RS法，另加常識(數(shù)一下峰!)，在大多數(shù)情況下將是最佳方案。< p> 　　至于譜峰拖尾影響因素是很多的，可解決的辦法有：　　在緩沖不好或離子強(qiáng)度過低的分離中，也會出現(xiàn)保留值重現(xiàn)性差和峰拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能大大改善此情況。柱子變得嚴(yán)重拖尾，甚至出現(xiàn)雙峰，通常是進(jìn)口濾板發(fā)生了部分堵塞或柱進(jìn)口處出現(xiàn)塌陷(可將空隙填滿接著反相沖洗柱子)。柱子出現(xiàn)峰展寬、拖尾則標(biāo)志著樣品中有保留性極強(qiáng)的“污物”在柱子的進(jìn)口處堆集起來。樣品在柱子上超載能引起峰展寬、拖尾(或伸舌)。通常減少進(jìn)樣量或提高檢測器靈敏度?！　≡绯龅姆逋衔沧钌跏莾x器存在柱外效應(yīng)的最好佐證。要排除柱外效應(yīng)，這不用我來說了吧! 　　分析酸性或堿性組分，一般必須采用緩沖液流動相。流動相中無緩沖液，樣品組分在柱內(nèi)形成譜帶的哪一部分會引起流動相pH增加或降低，樣品組分改變了電離程度，產(chǎn)生峰拖尾。緩沖液除了能改變峰形外，還能改變峰的保留。一般用中等偏高的濃度有利于減少峰拖尾(0.05～0.1mol/L)?！　∪邕€拖尾的話可加適量的修正劑!