微生物測(cè)定法
1.原理
生物素對(duì)于Lactobacillus plantarum（ATCC8014）的正常生長(zhǎng)是一種必需的營(yíng)養(yǎng)素，在一定生長(zhǎng)條件下，Lactobacillusplantarum的生長(zhǎng)與繁殖速度與溶液中生物素的含量成一定的線性關(guān)系，通過(guò)利用濁度法或光密度法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的強(qiáng)度可間接地測(cè)定出食物樣品中的生物素含量。最低檢出限為0.003ng。
2.適用范圍
本方法參考"Official Methods of Analysis of the Association of officialAnalytical Chemists"、"Methods of Vitamin Analysis"以及"Methods of theMicrobiological Analysis of SelectedNutrients"。本方法適用于測(cè)定各類食物及飼料中的生物素含量。
3.試劑
本試驗(yàn)所用水均為蒸餾水，所用試劑均需分析純?cè)噭?br /> 3.1 甲苯。
3.2 1 mol/L硫酸溶液：在600ml水中加入55.6ml濃硫酸，稀釋至1000ml。
3.3 3 mol/L硫酸溶液：在600ml水中加入166.7ml濃硫酸，稀釋至1000ml。
3.4 10mol/L氫氧化鈉溶液：溶200g氫氧化鈉于水中，定容至500ml。
3.5 1：1（1+1）乙醇溶液：500ml無(wú)水乙醇與500ml水充分混勻。
3.6 酸解酪蛋白：稱取50g不含維生素的酪蛋白于500ml燒杯中，加200ml 3mol/L鹽酸，121℃高壓水解6小時(shí)。將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在沸水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，如此反復(fù)3次，以去除鹽酸。以溴酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.5。加20g活性炭，振搖，過(guò)濾，如果濾液不呈淡黃色或無(wú)色，可用活性炭重復(fù)處理。濾液加水稀釋至500ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
?酸解的目的是為了消除酪蛋白中的維生素，確?；九囵B(yǎng)基中不含待測(cè)定的生物素，但有時(shí)酸水解不一定徹底，所以一定要選用不含維生素的酪蛋白粉（最好為Sigma公司產(chǎn)品），這樣可較好地確保酸解酪蛋白中不含生物素。
3.7 胱氨酸、色氨酸溶液：稱取4g L-胱氨酸和1g L-色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800ml水中，加熱至70～80℃，逐滴加入1：5（1+5）鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于4℃冰箱中保存。
3.8腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤（純度為98%）、鹽酸鳥(niǎo)嘌呤（生化試劑）以及尿嘧啶各0.1g于250ml燒杯中，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加鹽酸數(shù)滴，再加熱，如此反復(fù)，直至冷卻后無(wú)沉淀產(chǎn)生為止，以水稀釋至100ml，貯存于試劑瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
3.9維生素溶液：稱取20mg核黃素，10mg鹽酸硫胺素，10mg對(duì)氨基苯甲酸，40mg鹽酸吡哆醇，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。
3.10鹽溶液：稱取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO4 7H2O加23ml 85% H3PO4，用水溶解并定容至500ml。
3.11生物素標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液名稱
 濃度
 配置方法
 
標(biāo)準(zhǔn)

儲(chǔ)備溶液
 50μg / ml
 稱取25mg無(wú)水生物素用（1+1）乙醇溶液定至500ml，于4℃冰箱中貯存。
 
標(biāo)準(zhǔn)

中間液Ⅰ
 1μg / ml
 取5ml儲(chǔ)備液用（1+1）乙醇溶液定容至250ml，于2-4℃冰箱中貯存。
 
標(biāo)準(zhǔn)

中間液Ⅱ
 10 ng / ml
 取5ml中間液Ⅰ用（1+1）乙醇溶液定容500ml，于2-4℃冰箱中貯存
 
標(biāo)準(zhǔn)

工作液
 1 ng / ml
 取5ml中間液Ⅱ用去離子水定容至50ml，在2-4℃冰箱中貯存。
 

3.12基本培養(yǎng)基：將下列試劑混合于500ml燒杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚藍(lán)作外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH至6.8，用水稀釋至250ml。
酸解酪蛋白 25ml
胱氨酸、色氨酸溶液 25ml
腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml
維生素溶液 5ml
鹽溶液 5ml
無(wú)水葡萄糖 5g
無(wú)水醋酸鈉 5g
此培養(yǎng)基也可從Difco公司購(gòu)得，產(chǎn)品號(hào)為No.0419-15-8。
?由于國(guó)內(nèi)的某些試劑的純度不夠，所以自行配制的培養(yǎng)基較渾濁，且常有刺激細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)存在，因此嚴(yán)重影響到最后的濁度測(cè)定結(jié)果，建議使用商品化培養(yǎng)基。
3.12瓊脂培養(yǎng)基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g無(wú)水葡萄糖，2g無(wú)水磷酸二氫鉀，100ml番茄汁，10ml吐溫-80，5.0~7.5g瓊脂，加熱溶解，用（2+3）氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為6.5~6.8，然后定容至1000ml，分裝于試管，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出后豎直試管，待冷卻至室溫后于冰箱2-4℃保存。
3.13生理鹽水：稱取9.0g氯化鈉溶于1000ml水中，。每次使用時(shí)分別倒入2~4支10ml試管中，每支約加10ml，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，備用。
3.14 0.4g/L溴麝香草酚藍(lán)溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍(lán)于小研缽內(nèi)，加1.6ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.15 0.4g/L溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠于小研缽中，加1.4ml 0.1mol/L氫氧化鈉研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
3.16 1g/L溴酚藍(lán)乙醇溶液：稱取0.1g溴酚藍(lán)，用乙醇溶解后，加乙醇稀釋至100ml。
3.17番茄汁：將新鮮番茄去皮、去籽后，制成勻漿，用紗布多次過(guò)濾，直至濾液呈淡黃色透明液體，滴加幾滴甲苯于液體表面，放置冰箱中冷凍保存。
4.儀器與設(shè)備
（1） 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備
（2） 電熱恒溫培養(yǎng)箱
（3） 壓力蒸汽消毒器
（4） 液體快速混合器
（5） 離心機(jī)
（6） 分光光度計(jì)
（7） 硬質(zhì)玻璃試管：20mm×150mm
5.菌種與培養(yǎng)液的制備與保存
5.1 儲(chǔ)備菌種的制備：Lactobacillus plantarum（ATCC8014）接種于直面瓊脂培養(yǎng)管中，在37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~24小時(shí)，取出后放入冰箱中保存，每隔一周至少傳種一次。在實(shí)驗(yàn)前一天必須傳種一次。
5.2 種子培養(yǎng)液的制備：加2ml生物素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和3ml基本培養(yǎng)基于10ml離心管中，塞好棉塞，于121℃高壓滅菌10分鐘，取出，冷卻后于冰箱中保存。每次制備兩管，備用。
? 加入離心管中的生物素標(biāo)準(zhǔn)液要適量，過(guò)少會(huì)影響Lactobacillusplantarum的生長(zhǎng)，過(guò)多會(huì)使零管中的光密度值增大，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般2～3ml標(biāo)準(zhǔn)工作掖即可。
6.操作步驟
6.1 接種液的配制：使用前一天，將已在瓊脂管中生長(zhǎng)16～24小時(shí)的L.plantarum接種于種子培養(yǎng)液中，在37±0.5℃培養(yǎng)16～24小時(shí)，取出后離心10分鐘（3000rpm），棄去上清液，用已滅菌的生理鹽水淋洗2次，再加入3ml滅菌生理鹽水，混勻后，將此液倒入已滅菌的注射器中，立即使用。
? 菌種的淋洗一定要徹底，否則部分殘留在細(xì)菌表面的生物素會(huì)使空白管的光密度值升高，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
6.2樣品制備：稱取適量樣品，放入100ml三角瓶中，加50ml1mol/L硫酸（水解動(dòng)物樣品用3mol/L硫酸，水解植物樣品及混合型樣品用1mol/L硫酸），混勻后于121℃高壓水解90分鐘，取出冷卻至室溫。以溴甲酚綠為外指示劑，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4.5，將水解液移至100ml容量瓶中，定容，過(guò)濾。樣品水解液只能在4℃冰箱保存2～3天。取適量水解液于25ml具塞刻度試管中，以溴麝香草酚藍(lán)為外指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH為6.8，用水稀釋至刻度。
6.3 樣品試管的制備:于平行樣品管中分別加入1.0、2.0、3.0、4.0ml樣品水解液，加水至5ml，然后再加入5ml基本液體培養(yǎng)基。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管的制備:每組試管中分別加入生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，（相當(dāng)于0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ng）加水至5ml，再加入5ml基本液體培養(yǎng)基，需做三組標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.5 滅菌：樣品管與標(biāo)準(zhǔn)系列管均用棉塞塞好，于121℃條件下高壓滅菌10分鐘
? 滅菌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)破壞基本培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，影響Lactobacillusplantarum的生長(zhǎng)，最好在5-10分鐘內(nèi)。
6.6 接種與培養(yǎng)：待試管冷至室溫后，每管接種一滴種子液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)16~20小時(shí)。
?（1）接種前，接種室要在紫外燈下消毒至少30分鐘。（2）在接種時(shí)，其中一支標(biāo)準(zhǔn)系列0管可不接種，這樣可觀察此次實(shí)驗(yàn)是否存在污染，并且可消除由于管中液體的顏色造成的誤差。
6.7 測(cè)定：分光光度計(jì)，波長(zhǎng)550nm條件下，以標(biāo)準(zhǔn)系列0管調(diào)零測(cè)定樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的光密度值。
?首先以未接種的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行儀器調(diào)零，然后在用接種后的標(biāo)準(zhǔn)系列0管進(jìn)行二次調(diào)零，之后再測(cè)定其他管中液體的光密度值。兩次調(diào)零的目的在于徹底消除液體本身的顏色及污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.
7.計(jì)算
以生物素標(biāo)準(zhǔn)系列的不同納克數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在曲線上查出相對(duì)應(yīng)的樣品測(cè)定管中的生物素含量，然后再按以下公式計(jì)算樣品中生物素含量：
       c·V·f
X= ---------------- ×100
       m×1000
式中 X──樣品中生物素含量，μg/100g：
c──測(cè)定管中的生物素含量，ng：
V──樣品水解液的定容體積，ml：
f──樣品液的稀釋倍數(shù)
m──樣品質(zhì)量，g。
100/1000 ── 單位換算系數(shù)
8.注意事項(xiàng)
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一定要注意避免油脂的污染，因?yàn)楫?dāng)有油脂存在時(shí)，會(huì)刺激Lactobacillus plantarum（ATCC8014）快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致其生長(zhǎng)速度不再與生物素的含量呈線性關(guān)系。因此在實(shí)驗(yàn)前，要檢查所用玻璃器皿的表面是否已徹底清洗，操作者的雙手不要涂摸各種護(hù)手霜，以防此類油脂進(jìn)入被測(cè)液體中。