摘要
分光光度計(jì)分為：原子吸收分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)，其主要原理就是使用了分光光度法。
內(nèi)容
分光光度計(jì)分為：原子吸收分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、紅外分光光度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)，其主要原理就是使用了分光光度法。
分光光度法則是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長(zhǎng)范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū),(2)400～760nm的可見光區(qū),(3)2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。
分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。
使用方法：首先得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀 釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)
相關(guān)資料