一、高錳酸鉀滴定法
1.原理
樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，其中還原糖在堿性環(huán)境下將銅鹽還原為氧化亞銅，加硫酸鐵后，氧化亞銅被氧化為銅鹽，以高錳酸鉀溶液滴定氧化作用后生成的亞鐵鹽，根據(jù)高錳酸鉀消耗量計(jì)算氧化亞同含量，再查表得還原糖量。
2.適用范圍
GB5009.7-85，本法適用于所有食品中還原糖的測(cè)定以及通過酸水解或酶水解轉(zhuǎn)化成還原糖的非還原性糖類物質(zhì)的測(cè)定。
3.儀器
（1） 滴定管
（2） 25ml古氏坩堝或G4垂融坩堝
（3） 真空泵
（4） 水浴鍋
4.試劑
除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。
4.1 6 mol/L鹽酸：量取50ml鹽酸加水稀釋至100 ml。
4.2 甲基紅指示劑：稱取10mg甲基紅，用100ml乙醇溶解。
4.3 5 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取20g氫氧化鈉加水溶解并稀釋至100ml。
4.4 堿性酒石酸銅甲液：稱取34.639g硫酸銅（CuSO4·5H2O），加適量水溶解，加0.5ml硫酸，再加水稀釋至500ml，用精制石棉過濾。
4.5堿性酒石酸銅乙液：稱取173g酒石酸鉀鈉與50g氫氧化鈉，加適量水溶解，并稀釋至500ml，用精制石棉過濾，貯存于橡膠塞玻璃瓶中。
4.6精制石棉：取石棉先用3mol/L鹽酸浸泡2～3天，用水洗凈，再加2.5mol/L氫氧化鈉溶液浸泡2～3天，傾去溶液，再用熱堿性酒石酸銅已液浸泡數(shù)小時(shí)，用水洗凈。再以3mol/L鹽酸浸泡數(shù)小時(shí)，以水洗至不呈酸性。然后加水振搖，使成微細(xì)的漿狀軟縣委，用水浸泡并貯存于玻璃瓶中，即可用做填充古氏坩堝用。
4.7 0.1000mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4.8 1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g 氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100ml。
4.9 硫酸鐵溶液：稱取50g硫酸鐵，加入200ml水溶解后，慢慢加入100ml硫酸，冷卻后加水稀釋至1L。
4.10 3mol/L鹽酸：量取30ml鹽酸，加水稀釋至120ml。
5. 操作方法
5.1 樣品處理：
5.1.1 乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品：稱取約0.5～2 g固體樣品（吸取2～10 ml液體樣品），置于250 ml容量瓶中，加50ml水，搖勻。加入10 ml堿性酒石酸銅甲液及4ml1mol/L氫氧化鈉溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注：此步驟目的是沉淀蛋白）
5.1.2 酒精性飲料：吸取100 ml樣品，置于蒸發(fā)皿中，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發(fā)至原體積1/4后（注：如果蒸發(fā)時(shí)間過長(zhǎng)，應(yīng)注意保持溶液pH為中性），移入250ml容量瓶中。加50 ml水，混勻。以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.3 含多量淀粉的食品：稱取2～10 g樣品，置于250 ml容量瓶中，加200 ml水，在45℃水浴中加熱1h，并時(shí)時(shí)振搖。（注意：此步驟是使還原糖溶于水中，切忌溫度過高，因?yàn)榈矸墼诟邷貤l件下可糊化、水解，影響檢測(cè)結(jié)果。）冷卻后加水至刻度，混勻，靜置。吸取200ml上清液于另一250 ml容量瓶中，以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.4 含有脂肪的食品：稱取2～10g樣品，先用乙醚或石油醚淋洗3次，去除醚層。加入50ml水混勻，以下按5.1.1自"加10ml堿性酒石酸銅甲液"起依法操作。
5.1.5 汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取100 ml樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入250ml容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻后，備用。
5.2 樣品測(cè)定：
吸取50ml處理后的樣品溶液，于400ml燒杯中，加入25ml堿性酒石酸銅甲液及25ml乙液，于燒杯上蓋一表面皿，加熱，控制在4min內(nèi)沸騰，再準(zhǔn)確煮沸2min，乘熱用鋪好石棉的古氏坩堝或G4垂融坩堝抽濾，并用60℃熱水洗滌燒杯及沉淀，至洗液不成堿性為止。（注：還原糖與堿性酒石酸銅試劑的反應(yīng)一定要在沸騰狀態(tài)下進(jìn)行，沸騰時(shí)間需嚴(yán)格控制。煮沸的溶液應(yīng)保持藍(lán)色，如果藍(lán)色消失，說明還原糖含量過高，應(yīng)將樣品溶液稀釋后重做。）將古氏坩堝或垂融坩堝放回原400ml燒杯中，加25ml硫酸鐵溶液及25ml水，用玻棒攪拌使氧化亞銅完全溶解，以0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液滴定至微紅色為終點(diǎn)。
同時(shí)吸取50ml水，加與測(cè)樣品時(shí)相同量的堿性酒石酸銅甲、乙液，硫酸鐵溶液及水，按同一方法做試劑空白實(shí)驗(yàn)。
6. 計(jì)算：
X1=（V-V0）×N×71.54 （1）
式中： X1--樣品中還原糖質(zhì)量相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量，mg；
V--測(cè)定用樣品液消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；
V0--試劑空白消耗高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；
N--高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；
71.54--1ml 1mol/L高錳酸鉀溶液相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量，mg。
根據(jù)（1）式中計(jì)算所得氧化亞銅質(zhì)量，查附表"氧化亞銅質(zhì)量相當(dāng)于葡萄糖、果糖、乳糖、轉(zhuǎn)化糖的質(zhì)量表"，再計(jì)算樣品中還原糖含量。
X2=（m1×V2）∕（m2×V1）×（100∕1000） (2)
式中： X2--樣品中還原糖的含量，g/100g（g/100ml）；
m1--查表得還原糖質(zhì)量，mg；
m2--樣品質(zhì)量（或體積）， g（ml）；
V1--測(cè)定用樣品處理液的體積，ml；
V2--樣品處理后的總體積，ml。
7.舉例：
稱取某食物樣品3.00g，經(jīng)過處理后用水定容至250ml。取50ml進(jìn)行測(cè)定，消耗0.1003mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液5.20ml，同時(shí)測(cè)試劑空白為0.36ml，則 樣品中還原糖質(zhì)量相當(dāng)于氧化亞銅的質(zhì)量為：
X1（mg） =（5.20-0.36）×0.1003×71.54 = 34.73
查表得還原糖質(zhì)量為相當(dāng)于葡萄糖16.22 mg，
樣品中還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）為：
X2（g/100g）=（16.22×250）∕（3.00×50）×（100∕1000）= 2.70
8.注釋：
本法用堿性酒石酸銅溶液作為氧化劑。由于硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)可生成氫氧化銅沉淀，氫氧化銅沉淀可被酒石酸鉀鈉緩慢還原，析出少量氧化亞銅沉淀，使氧化亞銅計(jì)量發(fā)生誤差，所以甲、乙試劑要分別配制及貯藏，用時(shí)等量混合。
二、直接滴定法
1.原理
樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，在加熱條件下，直接滴定已標(biāo)定過的費(fèi)林氏液，費(fèi)林氏液被還原析出氧化亞銅后，過量的還原糖立即將次甲基藍(lán)還原，使藍(lán)色褪色。根據(jù)樣品消耗體積，計(jì)算還原糖量。
2.適用范圍
GB5009.7-85，本方法適用于所有食品中還原糖的檢測(cè)。檢出限0.1mg。
3.主要儀器
滴定管
4.試劑
除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 費(fèi)林甲液：稱取15 g硫酸銅（CuSO4·5H2O），及0.05 g次甲基藍(lán)，溶于水中并稀釋至1 L。
（2） 費(fèi)林乙液：稱取50 g酒石酸鉀鈉與75 g氫氧化鈉，溶于水中，再加入4 g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至500ml，貯存于橡膠塞玻璃瓶?jī)?nèi)。
（3） 乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加3 ml冰乙酸，加水溶解并稀釋至100 ml。
（4）亞鐵氰化鉀溶液。稱取10.6g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至100ml。
（5） 鹽酸。
（6） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取1.000 g經(jīng)過80 ℃干燥至恒量的葡萄糖（純度在99%以上），加水溶解后加入5ml鹽酸，并以水稀釋至1 L。此溶液相當(dāng)于1 mg/ml葡萄糖。（注：加鹽酸的目的是防腐，標(biāo)準(zhǔn)溶液也可用飽和苯甲酸溶液配制）
5.操作方法
5.1樣品處理：
5.1.1乳類、乳制品及含蛋白質(zhì)的食品：稱取約0.5～2 g固體樣品（吸取2～10 ml液體樣品），置于100 ml容量瓶中，加50ml水，搖勻。邊搖邊慢慢加入5 ml乙酸鋅溶液及5 ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注意：乙酸鋅可去除蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂等，使它們形成沉淀，經(jīng)過濾除去。如果鈣離子過多時(shí)，易與葡萄糖、果糖生成絡(luò)合物，使滴定速度緩慢；從而結(jié)果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結(jié)合，形成沉淀并過濾。）
5.1.2酒精性飲料：吸取50 ml樣品，置于蒸發(fā)皿中，用1mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發(fā)至原體積1/4后，移入100 ml容量瓶中。加25ml水，混勻。以下按4.1.1自"加5 ml乙酸鋅溶液"起依法操作。
5.1.3含多量淀粉的食品：稱取2～5 g樣品，置于100 ml容量瓶中，加50 ml水，在45℃水浴中加熱1h，并時(shí)時(shí)振搖（注意：此步驟是使還原糖溶于水中，切忌溫度過高，因?yàn)榈矸墼诟邷貤l件下可糊化、水解，影響檢測(cè)結(jié)果。）。冷后加水至刻度，混勻，靜置。吸取50ml上清液于另一100 ml容量瓶中，以下按4.1.1自"5 ml乙酸鋅溶液"起依法操作。
5.1.4汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取50 ml樣品置于蒸發(fā)皿中，在水浴上除去二氧化碳后，移入100ml容量瓶中，并用水洗滌蒸發(fā)皿，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻后，備用。
（注意：樣品中稀釋的還原糖最終濃度應(yīng)接近于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度。）
5. 2標(biāo)定費(fèi)林氏液溶液：吸取5.0 ml費(fèi)林氏甲液及5.0 ml乙液，置于150ml錐形瓶中（注意：甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉淀，應(yīng)將甲液加入乙液，使開始生成的氧化亞銅沉淀重溶），加水10ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以每?jī)擅?滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液蘭色剛好褪去并出現(xiàn)淡黃色為終點(diǎn)，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液總體積，平行操作三份，取其平均值，計(jì)算每10ml（甲、乙液各5ml）堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量（mg）。（注意：還原的次甲基藍(lán)易被空氣中的氧氧化，恢復(fù)成原來(lái)的藍(lán)色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態(tài)，并且避免滴定時(shí)間過長(zhǎng)。）
5.3樣品溶液預(yù)測(cè)：吸取5.0 ml費(fèi)林氏甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，并保持溶液沸騰狀態(tài)，待溶液顏色變淺時(shí)，以每秒1滴的速度滴定，直至溶液蘭色褪去，出現(xiàn)亮黃色為終點(diǎn)。如果樣品液顏色較深，滴定終點(diǎn)則為蘭色褪去出現(xiàn)明亮顏色（如亮紅），記錄消耗樣液的總體積。（注意：如果滴定液的顏色變淺后復(fù)又變深，說明滴定過量，需重新滴定。）
5.4樣品溶液測(cè)定：吸取5.0 ml堿性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置于150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2min內(nèi)加熱至沸，快速?gòu)牡味ü苤械渭颖阮A(yù)測(cè)體積少1ml的樣品溶液，然后趁沸繼續(xù)以每?jī)擅?滴的速度滴定直至終點(diǎn)。記錄消耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。
6.計(jì)算
X3 =（C×v1 × V）∕（m× v2 ×1000）×100
式中： X--樣品中還原糖的含量(以葡萄糖計(jì))，%；
C--葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/ml；
v1-- 滴定10 ml費(fèi)林氏溶液（甲、乙液各5 ml）消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；
v2--測(cè)定時(shí)平均消耗樣品溶液的體積，ml；
V--樣品定容體積，ml；
m--樣品質(zhì)量，g；
7.注意事項(xiàng)
（1）本方法測(cè)定的是一類具有還原性質(zhì)的糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖等，只是結(jié)果用葡萄糖或其他轉(zhuǎn)化糖的方式表示，所以不能誤解為還原糖=葡萄糖或其他糖。但如果已知樣品中只含有某一種糖，如乳制品中的乳糖，則可以認(rèn)為還原糖=某糖。
（2）分別用葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴定等量已標(biāo)定的費(fèi)林氏液，所消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積有所不同。證明即便同是還原糖，在物化性質(zhì)上仍有所差別，所以還原糖的結(jié)果只是反映樣品整體情況，并不完全等于各還原糖含量之和。如果已知樣品只含有某種還原糖，則應(yīng)以該還原糖做標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果為該還原糖的含量。如果樣品中還原糖的成分未知，或?yàn)槎喾N還原糖的混合物，則以某種還原糖做標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果以該還原糖計(jì)，但不代表該糖的真實(shí)含量。