孔雀石綠（MG）為三苯甲烷類工業(yè)染料, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以有效的預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小蟲病。并常用于魚苗的消毒。但一些水產(chǎn)品販運(yùn)商為保持水產(chǎn)品新鮮度普遍用MG消毒車廂和活魚池；酒店為了延長魚的存活時間也在魚池中投放MG進(jìn)行消毒。使用MG消毒后的魚即使死亡后顏色也較為鮮亮，消費(fèi)者很難從外表進(jìn)行辨認(rèn)。MG在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物為無色孔雀石綠（LMG）。MG具有毒性強(qiáng)、高殘留和致畸、致癌、致突變等副作用。LMG由于不溶于水，其殘留毒性比MG更強(qiáng)。所以，目前世界上諸如美國、日本、加拿大和歐盟等許多國家已將MG列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，我國也于2002年5月將其列入“食品動物禁用的獸藥及其化合物清單”^（1）。雖然MG已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，但因為其價格低廉，同時目前在水霉病防治上尚無其它有效藥品，因此仍有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖戶在普遍使用。

   各類水產(chǎn)品中MG和LMG的檢測是我國食品衛(wèi)生學(xué)面臨的新課題。為此，我國農(nóng)業(yè)部2004年頒布了水產(chǎn)品中MG殘留量測定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢驗法-液相色譜法（SC/T3021-2004）^（2）；國家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局和國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會于2005年亦發(fā)布了“液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法”和“高效液相色譜法”^（（GB/T19857-2005）^（3）的標(biāo)準(zhǔn)檢驗法。Chang-Jun Cha等報道了（2001）采用氰基柱的反相高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測MG^（4）。

在上述分析方法中，SC/T3021-2004采用C₁₈柱，等梯度洗脫方式，但需要較大流速（2ml/min）；而 GB/T19857-2005法采用C₁₈柱，梯度洗脫方式。文獻(xiàn)（4）采用氰基柱分離的梯度洗脫方式。我們在研究這些分析方法的基礎(chǔ)上，采用氰基柱分離、流速為1.0mL/min的等梯度洗脫方式，具有保留時間短、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑；最低檢測濃度無LMG為0.02μg/mL，MG為0.05μg/mL。精密度高；特別是線性范圍達(dá)0.1μg/mL～160.0μg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 SC/T3021-2004線性范圍（MG 0.01μg/m L～0.4μg/mL；LMG0.02μg/mL～0.40μg/mL）。而且，等梯度洗脫方式又?jǐn)U大了液相色譜的應(yīng)用范圍?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下：

1.     1材料

1.1.1試劑

    乙睛 色譜純，fishte ；

    乙酸銨 ，hplc純 ，DIKMA；

    孔雀石綠（MG） sigma試劑；

    無色孔雀石綠（LMG）  sigma試劑。

0.125mol/L乙酸銨溶液  稱取乙酸銨9.64 g，用純水溶解并定容至1000mL。用0.45μm濾膜過濾。

MG標(biāo)準(zhǔn)儲備液  準(zhǔn)確稱取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100 mL。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1mg/mL。避光、冰箱冷凍層保存。     

MG標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 吸取1mg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。

LMG標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取孔雀石綠0.100 0g，用乙睛溶解并定容至100mL。該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1mg/mL。

    LMG標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液  吸取1mg/mL無色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙睛稀釋至1.0μg/mL。

MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液  分別吸取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙睛稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.1.2 儀器

  高效液相色譜儀。

1.2 步驟

1.2.1 色譜條件

   檢測器  紫外-可見光檢測器，波長618nm；

   色譜柱  氰基柱，4.6mm×250mm，5μm；

   流動相  乙睛-0.125mol/L乙酸銨（pH4.5）=（47+53）；

   柱溫  35℃；

   進(jìn)樣量  20μL。

1.2.2  測定步驟 

吸取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（5.0μg/mL）注入色譜儀，在上述色譜條件下，繪制色譜圖。見圖1。

               

                   圖1. 5.0μg/mL孔雀石綠和無色孔雀石綠

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖

2.結(jié)果與討論

2.1流動相的選擇 MG和LMG的HPLC法分離，無論是C₁₈柱還是氰基柱，多采用乙睛和乙酸銨作流動相的反相體系^（1～4）。其中乙酸銨濃度對MG和LMG的分離有很大影響。對于梯度洗脫方式多采用50mmol/L乙酸銨溶液^{（2、3）}，而等梯度洗脫方式乙酸銨溶液濃度較大（0.125mol/L）^（1）。

2.2 流動相溶劑比例的影響  在上述色譜條件下，用1.0μg/mL MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)混合溶液在不同比例（V/V）乙睛-0.125mol/L乙酸銨溶液中觀察分離效果，結(jié)果表明，在乙睛-乙酸銨溶液（pH4.5）=47+53時分離效果好，靈敏度最高，所以選擇該溶劑比為流動相為。見表1。

                 表1       流動相溶劑比例對LMG/MG分離的影響

ACN/0.125mol/L乙酸銨        LMG               MG            

     （V/V）            TR（min）  A        TR（min） A    ΔTR（min）     

     40/60            10.56     65364      15.06      94433     7.1

     45/55            9.06      66962      13.14      111812    4.1

     47/53            8.70      67011      11.21      11.5076    2.5

     50/50            7.25      56335      8.51       99594     1.3

     55/45            6.62      ——       7.08       ——      0.4

2.3最低檢測濃度  在上述色譜條件下，以3S/N的響應(yīng)信號為最低檢測濃度，LMG的最低檢測濃度為0.02μg/mL，MG的最低檢測濃度為0.05μg/mL。均能滿足試驗要求。見圖2。

由圖可見，以取樣量10.0g計，最低檢測濃度LMG為2μg/kg，MG為5μg/kg。

 

                        

                                圖2      LMG和MG最低檢測濃度

2.4 線性范圍試驗  在上述色譜條件下，LMG和MG線性關(guān)系均良好。LMG和MG線性范圍為2μg/mL～160.0μg/mL，r ＞0.999。其中LMG和MG在0.2μg/mL～10.0μg/mL范圍的校正曲線見圖3；1.0μg/mL～160.0μg/mL范圍的校正曲線見圖4。

                         

                    

                (a)                              (b)

   圖3 LMG（a）和MG（b）校正曲線1（0.2μg/mL～10.0μg/mL）

                                        

（c）                                       （d）

圖4  LMG（c）和MG（d）校正曲線2（1.0μg/mL～160.0μg/mL）

 

2.5精密度試驗

在上述色譜條件下，分別用1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL LMG/MG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行性測定。保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般小于0.4%，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。見表2。

           表2 不同濃度LMG/MG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定精密度試驗

       

        LMG/MG              LMG        MG

（μg/mL）           TR    A     TR     A

          1.0                   9.13     94326   11.84   121590 

                                   9.11     91624   11.82   124395

                                   9.15     86984   11.82   126714

                                   9.10     94254   11.77   115168

                                   9.07     90030   11.73   115915

                                   9.12     88426   11.75   118041

X                    9.11    90940    11.78   120303

S                   0.02730  3023.7    0.04450  4695.3

RSD（%）            0.3      3.3      0.4      3.9

5.0                   9.01     346190  11.75   586155

                     8.91     334347   11.60   554314

                     8.89     350486   11.57   566958

                     9.07     337691   11.78   586993

                     9.06     333978   11.80   569882

                     9.01     328756   11.66   577275

X                   8.99     338575   11.69    573596

S                   0.07196  8198.3    0.09709  12493.2

RSD（%）            0.8      2.4       0.8     2.2              

10.0                 8.97     653769    11.63    1117447

                    9.03     689863     11.70    1147167

                    9.04     693111     11.71    1140571

                    9.00     681749     11.65    1264160

                    9.01     678101     11.67    1123467

X                   9.01    679318.6    11.68    1158562

S                   0.0270   15504.7     0.02750   60263

RSD(%)             0.3       2.3         0.2     5.0          

3樣品測定

3.1 樣品處理

3.2樣品測定

3.2.1校正曲線的繪制

3.2.2樣品測定

3.3 加標(biāo)回收率測定

4結(jié)論

      LMG和MG毒性強(qiáng)、具有很高的三致作用，其對水產(chǎn)品的人為污染應(yīng)受到嚴(yán)重關(guān)切。

LC5500高效液相色譜儀測定水產(chǎn)品中LMG和MG，具有方法簡便、分離效果好、分析速度快、節(jié)省試劑、精密度高、靈敏準(zhǔn)確、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中LMG和MG含量檢測。