粗多糖的測定方法
1. 原理
分子量大于10，000道爾頓的多糖經(jīng)80%乙醇沉淀后，加入堿性銅試劑，選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀出葡聚糖，沉淀部分與苯酚-H2SO4反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，在485nm條件下，有色物質(zhì)的吸光度值與葡聚糖濃度成正比。
2. 適用范圍
參照AOAC方法。適用于檢測含有分子量大于10，000道爾頓葡聚糖的樣品。
3.儀器
（1） 分光光度計
（2） 離心機(jī)
（3） 旋轉(zhuǎn)混勻器
（4） 恒溫水浴鍋
4.試劑
除特殊說明外，實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純。
（1） 80%乙醇：800ml無水乙醇加水200ml。
（2） 2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸餾水稀釋至1 L，加入固體無水硫酸鈉至飽和。
（3） 銅貯存液：稱取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g檸檬酸鈉加水溶解至1 L。溶液可貯存2周。
（4） 銅應(yīng)用溶液：取銅貯存液50 ml，加水50 ml混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g，臨用新配。
（5） 洗滌液：取水50 ml，加入10 ml銅應(yīng)用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混勻。
（6） 1.8 mol/L H2SO4：取100ml濃硫酸用水稀釋至1L。
（7） 20 g/L苯酚溶液：稱取2.0g苯酚，加水溶解并稀釋至100ml，混勻備用。
（8）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于稱量皿中，105℃干燥4h至恒重，置于裝有干燥硅膠的干燥器中冷卻。準(zhǔn)確稱取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.0mg/ml。
（9） 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液10ml，用水稀釋10倍，葡聚糖終濃度為0.1mg/ml。
5. 操作方法
5.1 樣品處理
（1） 樣品提取：稱取樣品1～5g，加水100ml，沸水浴加熱2h，冷卻至室溫，定容至200ml（V1），混勻后過濾，棄初濾液，收集余下濾液。
（2） 沉淀高分子物質(zhì)：準(zhǔn)確吸取上述濾液100ml（V2），置于燒杯中，加熱濃縮至10ml，冷卻后，加入無水乙醇40ml，將溶液轉(zhuǎn)至離心管中以3000rpm離心5min，棄上清液，殘渣用80%乙醇洗滌3次，殘渣供沉淀葡聚糖之用。
（3） 沉淀葡聚糖：上述殘渣用水溶解，并定容至50ml （V3），混勻后過濾，棄初始濾液后，取濾液2.0ml（V4），加入2.5mol/L NaOH2.0ml，Cu應(yīng)用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷卻后以3000rpm離心5min，棄上清液，殘渣用洗滌液洗滌3次，殘渣供測定葡聚糖之用。
（4） 測定葡聚糖：上述殘渣用2.0mL 1.8mol/LH2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。準(zhǔn)確吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml濃硫酸，沸水浴煮沸2分鐘，冷卻比色。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)含量，計算粗多糖含量。
5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：
精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分別相當(dāng)于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），補(bǔ)充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，濃硫酸10ml，混勻，沸水浴2分鐘，混勻，沸水浴2分鐘，冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，測定吸光度值（A），以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.計算
從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品相應(yīng)含量，計算粗多糖含量。 葡聚糖（ % ） =
 c× V5×V3×V1×0.1
 =
 c× 250
 ………………………（1 ）
 
V6×V4×V2×m
 m
 

公式中：c--從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定管中葡聚糖含量，mg；
V1--樣品提取時定容體積，ml；
V2--沉淀高分子物質(zhì)取液量，ml；
V3 --沉淀葡聚糖時定容量，ml；
V4 --沉淀葡聚糖時取液量，ml；
V5 --測定葡聚糖時定容體積，ml；
V6 --樣品比色管中取樣液體積，ml；
m--樣品稱量質(zhì)量，g；
0.1--將mg/g 換算成g/100g 的系數(shù)。
7.注意事項
（1） 苯酚-H2SO4溶液可以和多種糖類進(jìn)行顯色反應(yīng)，常用于總糖的測定。所以測定過程中應(yīng)注意容器及試劑中其他糖類的干擾。
（2）苯酚-H2SO4溶液和不同類的糖反應(yīng)，顯色的強(qiáng)度略有不同，反映在標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率不同。如果已知樣品中糖的結(jié)構(gòu)，應(yīng)盡量以同類糖的純品做標(biāo)準(zhǔn)品，或以含有已知濃度的同類產(chǎn)品做對照品進(jìn)行檢測分析；如果樣品中糖的類型未知或結(jié)構(gòu)多樣，則只能以葡萄糖計或其他糖計報告結(jié)果。
（3） 試驗證明葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、乳糖等雙糖、低聚糖--棉子糖，淀粉、糊精等多糖及甜味劑糖精不干擾粗多糖測定。