食物中色氨酸的測(cè)定--熒光分光光度法
1.原理
食物中蛋白質(zhì)在酸水解過程中，其色氨酸極易被分解，本法用堿水解蛋白質(zhì)，直接測(cè)定色氨酸的天然熒光。在蛋白質(zhì)水解液中，只有色氨酸和酪氨酸可以檢測(cè)到熒光。在pH為11時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度比酪氨酸大100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差40多nm，利用此特點(diǎn)，可在有大量酪氨酸的存在下，檢測(cè)色氨酸的含量。
2.適用范圍
參照中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫的食物營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定法第三版。適用于食物中色氨酸的測(cè)定。
3.儀器
3.1熒光分光光度計(jì)
3.2減壓蒸發(fā)器
3.3螺旋蓋大口瓶（瓶蓋要有橡皮墊）
3.4聚四氟乙烯管
3.5小玻璃球
3.6烘箱
4.試劑
（1）5mol/L NaOH：內(nèi)含0.5%可溶性淀粉，臨用前配制。
（2）4mol/L 尿素（pH=11）
（3） 6mol/L鹽酸
（4） 溴百里酚藍(lán)指示劑：稱取0.1g溴百里酚藍(lán)加0.1mol/L氫氧化鈉1.6ml，配成0.05%水溶液。
（5） 高純氮（含量99.999%）
（6） 辛醇甲苯溶液：內(nèi)含1%辛醇
（7） 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：（1mg/ml）：稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)，用0.005mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，貯存于冰箱保存。
5.操作步驟
5.1稱取含粗蛋白質(zhì)約5mg的食物樣品，置于聚四氟乙烯管中，加含可溶性淀粉的5mol/L氫氧化鈉1ml，加入1滴辛醇。
5.2將各管分別蓋上小玻璃球，放入1只帶螺旋蓋的大口玻璃瓶中，將瓶置于減壓蒸發(fā)裝置中，加冰和鹽降溫，減壓至真空度1.3Kpa10mmHg以下，繼續(xù)保持15min，充氮?dú)庠贉p壓，如此反復(fù)3次，迅速旋緊大口瓶的螺旋蓋。
5.3將充氮?dú)獾拇罂谄恐糜诳鞠鋬?nèi)，在110℃水解樣品22小時(shí)。
5.4冷卻大口瓶，用重蒸餾水將樣品分別洗至25ml容量瓶中，（內(nèi)含6N Hcl0.7ml）用溴百里酚藍(lán)為指示劑調(diào)pH至中性，用重蒸水定容至刻度。
5.5吸取樣品液1ml，于10ml帶蓋試管內(nèi)，用pH11的4mol/L尿素溶液稀釋至刻度，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm，發(fā)射波長(zhǎng)為360mm下測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色氨酸的熒光強(qiáng)度曲線，計(jì)算樣品中色氨酸含量。
5.6色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：用前將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋成每ml含100，200，300，400μg的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列。取每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液各1ml（雙份）與樣品管同樣加試劑，同時(shí)水解，以色氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.計(jì)算
每100g樣品中的色氨酸含量（mg）=
A×D×100
1000×W
式中
A：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的每ml測(cè)定液中色氨酸的含量（mg）
D： 稀釋倍數(shù)
W： 取樣量（克）